養好細胞注意點（二）

（一）何時須更換培養基。培養基中是否須添加抗生素。

視細胞生長密度而定，或遵照細胞株基本數據上的更換時間，按時更換培養基即可。

一般正常培養狀態下，培養基中可以添加抗生素。 按1％體積分數加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U／mL和100 μ／mL。

(二）貼壁細胞傳代時所使用的 trypsin-EDTA 濃度及相應處理

一般使用的 trypsin-EDTA 濃度為 0.25% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。*次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于 –20 ℃，避免反復冷凍解凍造成 trypsin 的活性降低，并可減少污染的機會.。

（三）將一般動物細胞離心下來，離心速率多少

回收動物細胞，其離心速率一般為 1 000 rpm，5~10 分鐘，過高的轉速，將造成細胞死亡。

（四）細胞的接種密度

依照細胞株基本數據上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長的重要原因之一。

（五）細胞冷凍培養基的成分及DMSO的等級

動物細胞冷凍保存時zui常使用的冷凍培養基是含 5~10% DMSO （dimethyl sulfoxide） 和 90~95 % 原來細胞生長用的新鮮培養基均勻混合。注意：由于 DMSO 稀釋時會放出大量熱能，故不可將 DMSO 直接加入細胞液中，必須使用前先行配制完成。冷凍保存使用的 DMSO 等級，必須為 Tissue culture grade 的 DMSO ，其本身即為無菌狀況，*次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中避光保存。

（六）冷凍保存細胞的方法及冷凍細胞濃度

將貼壁細胞消化后離心收集，懸浮細胞直接離心收集，以含有DMSO*培養基或胎牛血清的凍存液重懸細胞至終濃度約1x10⁶/ml。。以每管1～2ml分裝至凍存管中。用絕熱材料包裹置-70攝氏度冰箱冷凍。次日保存到液氮中。 

冷凍管內細胞數目一般為 1x10⁶ cells/ml vial，融合瘤細胞則以 5x10⁶ cells/ml vial 為宜。